백수오 (白首烏) Cynanchi Wilfordii Radix
이 약은 은조롱 Cynanchum wilfordii Hemsley (박주가리과 Asclepiadaceae)의 덩이뿌리이다.
성 상
이 약은 덩이뿌리로 원뿔모양이고 길이 5 ～ 10 cm, 지름 15 ～ 35 mm이다. 바깥면은 회황색 ～ 황갈색이며 세로주름이 많고 질은 단단하다. 꺾은 면은 흰색이다. 이 약을 현미경으로 보면 코르크층 아래 3 ～ 5 층의 석세포환이 군데군데 끊어져 있고 사관, 도관 및 가도관은 계단상으로 배열되어 있다. 모든 유세포에는 전분립이 들어 있고 수산칼슘의 족정이 있는 것도 있다.
이 약은 냄새가 없고 맛은 쓰고 달며 떫다.
확인시험
이 약의 가루에 수산화칼륨시액을 넣으면 노란색을 나타낸다.
순도시험
1) 중금속 가) 납 5 ppm 이하.
나) 비소 3 ppm 이하.
다) 수은 0.2 ppm 이하.
라) 카드뮴 0.3 ppm 이하.
2) 잔류농약 가) 총 디디티(p,p'-DDD, p,p'-DDE, o,p'-DDT 및 p,p'-DDT의 합) 0.1 ppm 이하.
나) 디엘드린 0.01 ppm 이하.
다) 총 비 에이치씨(α,β,γ 및 δ-BHC의 합) 0.2 ppm 이하.
라) 알드린 0.01 ppm 이하.
마) 엔드린 0.01 ppm 이하.
3) 이산화황 30 ppm 이하.
4) 이엽우피소 이 약 10 g을 멸균한 막자와 막자사발을 사용하여 액체질소로 순간적으로 조직을 얼린 상태에서 가루로 하여 사용한다. 이 약 100 mg을 정밀하게 달아 유전자 증폭반응 조작에 따라 DNA (이하 유전자라 한다)를 분리․정제하여 검액으로 한다. 따로 백수오표준생약 약 100 mg을 정밀하게 달아 검액과 같이 조작하여 대조액으로 한다.
유전자 분리 및 증폭반응 (PCR, Polymerase Chain Reaction)
가) 유전자 분리
이 약 100 mg에 500 μL의 lysis 용액 (20 mM Tris․HCl pH 8.0, 2 mM Sodium EDTA, 12 % Triton X-100, Lysome 20 mg/mL) 및 proteinase K 용액 (600 mAU/mL 이상) 10 μL를 넣고 37 ℃ 항온에서 1 시간 반응시킨다. 그 후 CTBA 용액 (0.1 M Tris․HCl pH 8.0, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA pH 8.0, 2 % hexadecyltrimethylammonium bromide, 0.2 % β-mercaptoethanol) 400 μL를 넣고 65 ℃ 항온에서 30 분간 반응시킨다. 이 반응물에 페놀․클로로포름․이소아밀알콜혼합액 (25 : 24 : 1) 600 μL와 정제수 300 μL를 넣고 20 ℃를 유지하며 14,000 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 상층액을 취하고 여기에 이소프로판올 600 μL를 넣고 20 ℃를 유지하며 14,000 rpm에서 10 분간 원심 분리한다. 침전된 유전자를 70 % 에탄올 500 μL로 2 ∼ 3 회 세척하고 상온에서 건조시킨다. 건조된 유전자를 멸균된 정제수 30 μL로 녹여 4 ℃에서 1 시간 방치한 다음 RNase (100 mg/mL, 7,000 units/mL) 2 μL를 넣고 37 ℃에서 30 분간 반응시킨다. 분리된 유전자는 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정한 다음 농도 및 순도를 다음과 같이 계산한다.
유전자 농도 (μg/mL) = 50 μg/mL × A260 nm × 희석배수
(단, A260 nm = 1 일 때 유전자 농도는 50 μg/mL 인 것으로 하여 희석한다.)
유전자 순도 : A260 nm / A280 nm = 1.6 ∼ 2.0
(또는 분리된 유전자는 1.0 % 아가로즈겔 전기영동법으로 농도 및 분리 상태를 확인할 수 있다.)
※ 위 시험과정은 상용화된 유전자 분리․정제 키트를 사용할 수 있으며, 해당 제조사의 사용방법을 참고하여 유전자를 분리한다.
※ PCR법은 증폭하고자 하는 주형 유전자가 미량 존재하여도 증폭되므로 분리된 유전자 이외의 유전자가 혼입되지 않도록 실험에 사용되는 기구 및 시약 등의 실험실 환경 관리에 주의해야 한다.
- 실험자는 실험용 고무장갑을 착용하고, 실험대는 70 % 에탄올로 깨끗이 닦는다.
- 유전자를 취급할 때는 외부 공기와 접촉이 없는 무균상자 등의 독립된 공간을 이용하며, 열에 불안정한 시액을 제외한 micro tube/tip 및 증류수 등은 121 ℃에서 15 분 이상 멸균하여 사용한다.
- 본 실험에서 증류수는 특별한 사유가 없는 한 DNA, DNase 등의 오염이 없는 초순수를 말한다.
나) 유전자 증폭반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)
샘플 유전자에 대한 PCR은 1회 확인시험으로 실시하되 백수오·이엽우피소 특이 프라이머로 각각 PCR을 진행하고, 실험조건에 의한 오염을 확인하기 위해 “음성대조군” (주형 유전자 대신 멸균증류수 첨가)을 실험에 포함시킨다.
유전자 증폭반응은 멸균된 0.5 mL 튜브에 PCR용 완충액 (10 × amplification buffer)에 forward primer (10 pmole) 2 μL, reverse primer (10 pmole) 2 μL 와 분리한 주형 유전자 (농도 약 20 ng/μL) 1 μL를 넣고 멸균 정제수로 최종 반응액을 20 μL로 한다. PCR 반응조건은 아래 표와 같다.
※ 상기 PCR 조건은 기기 및 실험환경에 따라 변형할 수 있으며, PCR에 사용되는 시약도 상용화된 키트를 사용할 수 있으며 제조사의 권장조건을 따른다.
| 온 도 | 시 간 | cycle 수 | |
| 최초 변성 (predenaturation) | 95 ℃ | 4 분 | 1 |
| 변성 (denaturation) 결합 (annealing) 증폭 (extension) | 95 ℃ 56 ℃(백수오) 49 ℃(이엽우피소) 72 ℃ | 30 초 30 초 40 초 | 34 |
| 최종 증폭 (elongation) | 72 ℃ | 5 분 | 1 |
| 보 존 | 4 ℃ | - | - |
※ 최초 변성 시간은 taq 조건에 따라 변경가능하며, 결합(annealing) 온도는 primer의 Tm 값과 PCR 결과에 따라 조정 가능하다.
* Primer
| Target region | Primer | 염기서열 |
| 백수오 특이프라이머 | CwF | 5‘-GATATTGCTCCTTTATTTTCT-3' |
| CwR | 5'-TAGAATATTTTAGAATCTAATTTTA-3' | |
| 이엽우피소 특이프라이머 | CaF | 5'-ATTGAATTTAAAAATTCAAGAC-3' |
| CaR | 5'-AGTTCTATTTCTATTTATTTTTAT-3' |
다) 전기영동
PCR 증폭 결과는 아가로즈 겔 또는 폴리아크릴아마이드 겔을 이용한 전기영동법으로 확인하며, 여기에서는 아가로즈 겔 방법을 제시한다.
아가로즈 겔의 첫 번째 홈에는 PCR 증폭산물의 크기를 식별할 수 있는 사이즈마커(100 bp PCR size marker)를 넣고 두 번째 홈부터 PCR 증폭산물을 넣는다. 이 때 검액은 10 μL를 넘지 않도록 한다. 전기영동의 전압과 시간은 겔의 농도와 크기에 따라 조절한다(아가로즈 겔 2 %, 전기영동 100 V, 30 분 ∼ 1 시간). 전기영동이 끝난 겔은 에티디움브로마이드 (EtBr) 염색법으로 처리하여 증폭산물을 확인한다.
※ 에티디움브로마이드(EtBr)는 인체에 해로운 시액으로 피부와 직접접촉이 없도록 장갑과 마스크를 착용하고 취급에 주의한다. 폐액은 반드시 지정된 폐기물통을 이용하여야 한다.
라) 결과 확인 및 판정
염색이 끝난 아가로즈 겔을 영상분석장치(UV trans-illuminator)를 통해 증폭밴드를 확인할 수 있다. 이때 모든 음성대조군은 불검출이어야 한다. 검액에서 확인된 증폭밴드는 대조액과 동일한 증폭밴드가 검출되어야 하며 백수오 특이프라이머에 양성, 이엽우피소 특이프라이머에 음성이어야 한다. 본 실험에 대한 결과 판정은 유전자 분리부터 증폭반응까지 2회 반복 실험을 하여 그 결과가 동일하게 나타나야 한다.
건조감량
17.0 % 이하.
회 분
4.0 % 이하.
산불용성회분
1.0 % 이하.
엑스함량
묽은에탄올엑스 15.0 % 이상.
저 장 법
밀폐용기.