오소판물질 Ossopan Substance
이 약은 2 개월 미만의 송아지의 장골을 가지고 제조하며, 뼈가 함유하는 무기질 이외에도 유기질을 함유하고 있으며, 건조물은 칼슘 (Ca : 40.08) 18.2 ～ 24.6 %, 인 (P : 30.97) 8.4 ～ 11.4 %, 콜라겐 23.0 ～ 31.0 %, 기타 단백 5.6 ～ 10.4 %, 잔류무기염류 1.8 ～4.2 % 및 미량원소 F, Mg, Fe, Zn, Cu, Ni를 함유한다.
제 법
수의사의 건강증명이 붙은 2개월 미만의 송아지 장골을 분쇄하여 원료로 하며 저장과 수송은 -30 ℃이하, 모든 전처리 제조과정은 0 ℃이하에서 행한다. 분쇄는 30 ℃이하, 탈수는 40 ℃이하. 진공공정을 거쳐 유기용매로 추출하고 용매는 제거시킨다.
성 상
이 약은 회백색의 미세한 과립상 분말로서 건조한 장기분말의 냄새를 지니며 밀도는 약 0.5 g/mL이다.
확인시험
1) 오소판물질 이 약 600 mg을 마개달린 원심분리관에 넣고 물 10mL를 넣어 실온에서 2시간 세게 진탕하여 원심분리(4,000 rpm, 5 분간)시킨다. 이 액의 상층 물층을 검액으로 한다. 따로 오소판물질 약 600 mg을 달아 검액과 동일하게 처리하여 표준액으로 한다. 이들 액을 가지고 박층크로마토그래프법에 따라 시험한다. 검액과 표준액 각 20 μL씩을 MN300 Cellulose을 써서 만든 박층판에 점적한다. 다음에 1-프로판올․25 % 암모니아시액․물혼합액(6 : 3 : 1) 또는 포화황산암모늄액․물․ 2 -프로판올혼합액(79 : 19 : 2)을 전개용매로 하여 약 10 cm 전개한 다음 박층판을 바람에 말린다. 여기에 자외선 (주파장 254 nm 및 365 nm)을 쪼일 때 검액에서 얻은 여러 개의 반점은 표준액에서 얻은 반점과 색상 및 R f 값이 같다.
2) 인산칼슘 ① 칼슘의 확인 : 이 약 약 100 mg을 달아 아세트산(100) 3mL와 물 5 mL를 넣고 잠깐 끓인 다음 여과한다.(A액) 이 액 1 mL를 3.5 % 옥살산암모늄용액 1 mL와 혼화하면 백색 결정성 침전물이 생성되며, 이 침전물에 10 % 염산을 넣으면 용해되고 3 %암모니아 용액을 넣으면 다시 침전된다.
② 인산기의 확인 : A 액 1 mL와 몰리브덴산바나딘산암모늄 시액 2 mL를 혼화하면 노란색을 나타낸다.
○ 몰리브덴산바나딘산암모늄시액 : 칠몰리브덴산육암모늄사수화물 4 g을 물 40 mL에 녹이고 따로 바나딘산암모늄 0.1 g을 물 30 mL에 녹인 다음 두 용액을 혼화한다. 이 용액에 55 % 질산 20 mL를 넣어 혼화하고 물로 희석하여 100 mL로 한다.
3) 콜라겐성 물질 이 약 약 125 mg을 마개있는 시험관에 넣고 물 6 mL를 넣어 Autoclave에 넣어 1 bar로 3시간 동안 내압증기멸균하고 냉각 후에 여과하고 여과지를 소량의 물로 세척한다. 여액을 1 mL가 될 때까지 감압증류시키고 6 mol/L 염산 6 mL를 넣는다. 용액을 시험관에 넣고 105 ℃로 15 시간 동안 건조시킨다. 식힌 다음 여과하고 여과지를 소량의 물로 세척한 다음 여액을 감압증류하고 잔류물에 물 2 mL를 넣어 녹여 검액으로 한다. 따로 「히드록시프롤린」 4.5 mg을 달아 물 2 mL를 넣고 균일하게 혼화하여 표준액으로 한다. 이들 액을 가지고 박층크로마토그래프법에 따라 시험한다. 검액 및 표준액 1 μL씩을 MN300 Cellulose을 써서 만든 박층판에 점적한다. 다음에 즉시 냉풍건조하고 포화시키지 않은 전개조에서 2 -프로판올․물․포름산혼합액(20 : 5 : 1)을 전개용매로 하여 약 3시간 전개시킨다. 전개 후 30 분간 냉풍건조하고 다시 3-부탄올․메틸에틸케톤․25 %암모니아시액․물혼합액(5 : 3 : 1 : 1)을 전개용매로 하여 약 3 시간 전개시킨 다음 30 분간 온풍건조한다. 여기에 닌히드린시액을 고르게 뿌린 다음 90 ℃로 가열할 때 많은 반점이 즉시 나타나고 일부는 5 ～ 10 시간 후에 나타난다. 검액에서 얻은 여러 개의 반점 중 1개의 반점은 표준액에서 얻은 반점과 색상 및 R f 값이 같다. 프롤린과 히드록시프롤린은 노란색 반점이고, 그 외는 청자색 반점으로 나타난다.
○ 닌히드린용액 : 에탄올(99.5) 70 mL에 닌히드린 0.1 g을 녹이고 2,4,6-콜리딘 2.9 mL와 아세트산(100) 21 mL를 넣어서 혼화한다.
순도시험
중금속 총 중금속 30 ppm 이하
수 분
10 % 이하 (수분측정법)
회 분
48.5 ～ 65.5 %
미생물한도
시험할 때 적합하다.
정 량 법
1) 칼슘 이 약 약 1 g을 사기도가니에 정밀하게 달아 탄화시킨 다음 회화로에서 500 ～ 600 ℃로 완전하게 회화시킨다(약 5시간). 실리카겔 데시케이터에서 식힌 다음 6 mol/L 염산 5 mL 씩 2 회 용해 세척하여 100 mL 용량플라스크에 옮기고 물로 완전히 세척하여 표선을 채운다. 이 용액 중 10 mL를 취하여 물로 희석하여 300 mL로 한다. 에리오크롬블랙T․염화나트륨 지시약을 소량 넣고 암모니아․염화암모늄 완충액 (pH 10.0)을 가하여 pH 10.0으로 한다(액은 붉은색). 이 액을 0.1 mol/L 에틸렌디아민테트라아세트산디나트륨시액으로 적정한다. 다만, 적정의 종말점은 액이 붉은색에서 청색으로 변할 때로 한다. 같은 방법으로 공시험을 하여 보정한다 (검액의 적정 소비량 A mL, 공시험액의 적정 소비량 B mL).
W : 검체의 양 (mg)
0.4 : 오소판물질 중 마그네슘의 실험적 함량값
0.1 mol/L 에틸렌디아민테트라아세트산디나트륨 1 mL = 4.0 mg 칼슙
2) 인 이 약 100 mg을 정밀하게 달아 사기도가니에 넣고 탄화시킨 다음 회화로(500 ～ 600℃)에서 완전히 회화시키고(약 5시간) 실리카겔 데시케이터에서 식힌 다음 6 mol/L 염산 5mL 씩으로 2 회 용해, 세척하여 100mL 용량플라스크에 옮기고 물로 완전히 세척하여 표선을 채운다. 이 용액 20 mL을 취하여 100 mL 용량플라스크에 넣고 올리브덴산바나딘산암모늄시액 25 mL을 넣은 다음 물로 표선을 채운다. 30 분간 방치한 다음 이 용액 5 mL을 취하여 20 mL 용량플라스크에 넣고 물로 채워 검액으로 한다. 따로 인산이수소칼륨 4.3935 g을 물에 녹여 1 L로 한다. 이 액 2.0 mL에 몰리브덴산바나딘산암모늄시액 25 mL을 넣고 물을 넣어 100 mL로 한 다음 30 분간 방치한다. 이 용액 5 mL을 취하여 20 mL 용량플라스크에 넣고 물로 표선까지 채워 표준액으로 한다. 따로 몰리브덴산바나딘산암모늄시액 25 mL에 물을 넣어 100 mL로 하여 30 분간 방치한다. 이 용액 5 mL를 취하여 20 mL 용량플라스크에 넣고 물로 표선까지 채워 대조액으로 한다. 대조액을 대조로 하여 파장 375 nm에서 표준액과 검액의 흡광도 A s 및 A T 를 측정한다.
3) 콜라겐 이 약 약 100 mg을 정밀하게 달아 100 mL 둥근플라스크에 넣고 6 mol/L 염산 10 mL를 넣고 환류냉각기를 달고 105 ℃에서 20 시간 자석교반기로 교반하여 가수분해시킨다. 식힌 다음 100 mL 비커에 물 50 mL로 잘 세척하여 옮긴 다음 32 % 수산화나트륨과 묽은 염산을 사용하여 pH 5～7로 맞추고 식힌 다음 100 mL 용량플라스크에 물로 잘 세척하여 옮기고 물로 표선을 채운 다음 여과한다. 따로 히드록시프롤린 표준품 50 mg을 물에 녹여 500 mL로 하여 표준원액으로 한다. 이 액 5 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 25 mL를 취하여 각각 50 mL 용량플라스크에 넣고 물로 표선까지 채워 표준검량선을 작성한다.
(S1 : 10 μg/mL, S2 : 20 μg/mL, S3 ; 30 μg/mL, S4 : 40 g/mL, S5 : 50 μg/mL)
물 2 mL (대조액), 검액 2 mL 및 표준액 (S1 ～ S5) 2 mL씩을 정확하게 취해 각각 25 mL씩 용량플라스크에 넣고 0.01 mol/L 황산용액, 2.5 mol/L 수산화나트륨액, 6 % 과산화수소수 2 mL씩을 차례로 넣어 혼화한 다음 5 분간 가끔 흔든 다음 80 ℃ 수욕에서 때때로 세게 흔들어 주면서 5 분간 가온한다. 각 시험액을 빙수욕에서 식히고 1.5 mol/L 황산 8 mL씩을 흔들어 주면서 넣은 다음 4-디메틸아미노벤즈알데히드의 1-프로판올용액 (5 %) 4 mL를 넣어 잘 혼화한다. 70 ℃ 수욕에서 16 분간 가온한 다음 흐르는 물로 식히고 대조액을 대조로 파장 555 nm에서 표준액과 검액의 흡광도 A S 및 A T 를 측정한다.
계 산 : 검액의 히드록시프롤린의 양을 표준검량선으로부터 읽는다. 여기서 읽은 수치의 1/10 (A)에 factor 7.46을 곱하여 콜라겐의 양(%)을 계산한다. (콜라겐 물질은 히드록시프롤린을 13.4 % 함유하므로 factor는 7.46이다).
콜라겐의 함량 (%) = A × 7.46 × × 100
A : 검체중의 히드록시프롤린의 양 (mg),
즉 검량선으로부터 얻은 수치 ×
4) 기타 단백질 이 약 약 400 mg을 정밀하게 달아 킬달플라스크에 넣고 황산 8 mL, 30 % 과산화수소수 1 mL 및 황산동 1 g 과 황산칼륨 9 g의 혼합물 1 g을 넣은 다음 용액이 맑은 청색이나 무색이 될 때까지 가열 분해시킨다. 이 액을 100 mL용량플라스크에 옮기고 물로 표선을 채운다. 이 용액 25 mL를 취하여 30 % 수산화나트륨액 15 mL를 넣어 증류액을 받고 과량의 염산을 0.1 mol/L 수산화나트륨액으로 역적정한다.
계 산 : 0.1 mol/L 염산 1mL = 1.4 mg 질소 (N)
기타 단백질의 양 (mg) = (A- )× 6.25
A : 총 질소의 양 (mg)
B : 콜라겐의 양 (mg), 콜라겐은 약 18.18 %의 질소를 포함하므로 factor는 5.5이다.
6.25 : 기타 단백질에 대한 질소의 factor
5) 미량원소 가) 불소의 검출 50 mL 플라스틱 비커에 6 mol/L 염산 0.5 mL와 물 20 mL를 넣고 이 약 400 mg과 함께 섞으면서 저어준다. 25 ℃ 항온에서 TISAB 완충액 20 mL를 넣어 검액의 이온농도를 측정하고 따로 플라스틱용기에 불화나트륨을 녹여 각각 10 -6 , 10 -5 , 10 -4 mol/L 용액을 만든다. 불소표준용액의 각 이온농도를 측정할 때 검액의 불소농도는 10 -5 mol/L 이상이어야 한다.
○ TISAB 완충액 : 100 mL 용량플라스크에 염화나트륨 5.6 g, 아세트산 (31) 5.7 g과 CyDTA (1,2-diamino cyclohexanetetraacetic acid) 500 mg을 물에 녹이고 용액의 pH가 5.0 ～ 5.5가 되도록 수산화나트륨액으로 조정한 다음 물로 표선을 채운다.
나) Mg, Fe, Zn, Cu, Ni 의 검출 이 약 약 1 g을 정밀하게 달아 사기도가니에 고르게 펴 탄화시킨 다음 회화로에서 500 ～ 600 ℃ 로 약 5 시간 완전히 회화시킨다. 실리카겔 데시케이터에서 식힌 다음 6 mol/L 염산 5 mL씩 2 회 용해 세척하여 100 mL 용량플라스크에 옮기고 물로 완전히 세척하여 표선을 채워 검액으로 한다. 검액을 원자흡광광도법에 따라 시험할 때 각각의 원소는 다음 파장에서 흡수극대를 나타낸다.
Mg : 285.2 nm, Fe : 248.3 nm, Zn : 213.9 nm, Cu : 324.8 nm, Ni : 232.0 nm
저 장 법
기밀용기.